华南虎皮肤成纤维细胞离体培养体系的初步建立

  马勇江1，王兴金2，李玉谷1，黄志宏2，黄勉2，毛三英1
（1华南农业大学 兽医学院，广东广州 510642；2 广州动物园，广东广州 510642）

摘要：简要介绍了华南虎皮肤成纤维细胞的分离培养和冷冻保存。在研究中，采用酶消化法（胶原酶消化：0.1%胶原酶I型＋0.1%BSA；胰蛋白酶消化：0.25%胰蛋白酶＋1mM EDTA）和植块法分离皮肤成纤维细胞。研究结果表明，DMEM/F12(1:1)培养基＋10％FBS＋10ng/ml EGF+5μg／ml Insulin＋100IU／ml青霉素＋100μg／ml链霉素组成的培养体系用于皮肤组织的消化培养和植块培养，胶原酶消化法和植块法成功获得华南虎皮肤成纤维细胞。用10％DMSO＋20％FBS＋70％DMEM/F12培养基组成的冷冻保存液对细胞进行冷冻保存，解冻后获得91.1％的活率，解冻细胞再次培养能正常生长。

关键词：华南虎；成纤维细胞；体外培养；皮肤
        华南虎(Panthera tigris amoyensis)为我国特有的珍稀濒危动物，其保护拯救工作已引起了国内外有关组织、机构和专家、学者的高度重视。但与国内对大熊猫的保护拯救取得了举世瞩目的成就相比，国内对华南虎只进行了一些极为初步的基础研究。目前，国内在以精子库、卵子库、胚胎库、体细胞库等为主要内容的华南虎基因资源保存库建设方面的工作才刚刚开展（韩宗先，2004），有关华南虎体细胞库建立方面的研究尚为空白。利用细胞离体培养技术，分离培养华南虎皮肤成纤维细胞不仅可以使华南虎的遗传资源得到长期保存，而且可以为研究者提供丰富的研究材料，在细胞水平上研究华南虎基因资源保护问题。本文扼要地介绍了华南虎皮肤成纤维细胞的离体培养体系和冷冻保存方法。

1 材料与方法
1.1 主要试剂
        DMEM/F12(1:1)培养基（Gibco公司，11330），胶原酶Ⅰ型（Sigma公司，C0130），PBS缓冲液（Gibco公司），胰蛋白酶(Amresco公司，0458，Lot.#2006B014)，牛血清白蛋白(BSA；Roche公司)，EDTA(Amresco公司，0105)，表皮细胞生长因子（EGF；Pepro Tech公司，Cat.#100-15），胰岛素（insulin；Sigma公司，I5500），四甲基偶氮唑盐（MTT；Sigma公司），二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司)，青链霉素（TBD公司），胎牛血清（FBS；Gibco公司），台盼蓝（Sigma公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 皮肤组织的采集
        华南虎（15岁，雄性，广州市动物园）麻醉后，虎尾中段背侧剃毛消毒(碘酒消毒后立即用75％的酒精脱碘)后，用止血钳夹起皮肤，再用手术刀片切割夹起的皮层，取大小约为1.0×0.5cm2皮肤块，然后迅速将其放人含高浓度青链霉素（500IU／ml青霉素＋500μg／ml链霉素）的PBS缓冲液中，置4℃冰盒中带回实验室进行分离培养。从采样到分离培养，时间最好不要超过12h。
1.2.2 皮肤成纤维细胞的分离
        将华南虎皮肤组织块在含青链霉素（100IU／ml青霉素＋100μg／ml链霉素）的PBS缓冲液中洗涤数遍，去血污及毛发，然后剪成1 mm3大小的小块，再用上述PBS缓冲液清洗至液体清亮，静置，去上清，分成4份用于以下不同的分离培养方法。
胶原酶消化法：在37℃下用胶原酶消化液（0.1%胶原酶I型＋0.1%BSA）持续酶解30min～1 h，期间振荡4-5次，待皮肤组织呈絮状时，用等体积培养液（DMEM/F12(1:1)培养基＋10％FBS＋100IU／ml青霉素＋100μg／ml链霉素）中止酶解，吸管吹吸打散，200目筛网过滤，1000rpm离心洗涤滤过液1～2次。细胞团用完全培养液（DMEM/F12(1:1)培养基＋10％FBS＋10ng/ml EGF+5μg／ml Insulin＋100IU／ml青霉素＋100μg／ml链霉素）重悬，血球计数法测量细胞密度，按2×105/60mm培养皿细胞密度，在饱和湿度，5％ CO2，37℃ 的CO2培养箱中进行培养。
胰蛋白酶消化法：在37℃ 下用胰蛋白酶消化液（0.25%胰蛋白酶＋1mM EDTA）持续酶解20min～40 min，或4℃下过夜消化，其它步骤同胶原酶消化法。
植块法：将皮肤组织小块移人六孔板（Corning，353014），每孔3～4块组织小块，用微量移液枪在组织小块的周缘滴加微量完全培养液，在饱和湿度，5％ CO2，37℃ 的CO2培养箱中培养2 h，之后再加少量完全培养液（不浸没组织块）继续培养24h，最后加完全培养液浸没组织块。之后每2 d更换2／3的培养液。